. 引言

沃特世XBridge BEH SEC 200Å和450Å 3.5 μm蛋白分析柱，設(shè)計用于補充現(xiàn)有基于UPLC的SEC應(yīng)用，配合傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)按SEC方法檢測肽或蛋白。這些新的HPLC型SEC填料，基于沃特世亞乙基橋雜化（BEH）顆粒技術(shù)及其表面覆蓋的二醇基鍵合相，與已經(jīng)得到成功運用的UPLC SEC柱系列的色譜填料化學(xué)性質(zhì)*一致。這為了色譜技術(shù)人員提供了更多選擇，能夠基于實驗室儀器平臺與樣品組分分離度情況或樣品分析通量需求輕松轉(zhuǎn)換。

所有基于BEH的SEC色譜柱，都是在通過cGMP（現(xiàn)行GMP）和ISO9001認(rèn)證的工廠里采用超純試劑生產(chǎn) 而得。生產(chǎn)出的每個批次填料，經(jīng)過一系列標(biāo)準(zhǔn)QC測試（例如，粒徑與孔徑分布），之后使用合適的肽和蛋白混標(biāo)進(jìn)行特定應(yīng)用測試。然后，對每一批獲得批準(zhǔn)放行的填料所裝填出的每一根SEC色譜柱，再進(jìn)行柱效測試。通過這樣的質(zhì)控過程，來確保在研發(fā)或?qū)Ω咭蟮尿炞C方法提供批與批間、柱與柱間的重現(xiàn)性。

圖1. 在XBridge BEH SEC 200Å和450Å蛋白分析柱上的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

II. 用于SEC蛋白質(zhì)分離的系統(tǒng)因素

a.啟動

為了獲得沃特世 XBridge BEH SEC蛋白分析柱的*性能，正確配置您的LC系統(tǒng)很重要。我們建議只使用預(yù)切管路，且所有連接管的內(nèi)徑為0.005”或更小，以達(dá)到*色譜性能。

對于既有LC系統(tǒng)，要進(jìn)行SEC分析，可能需要進(jìn)行一些改造。請參考“使用ACQUITY UPLC系統(tǒng)進(jìn)行分子排阻色譜和離子交換色譜分析蛋白質(zhì)”

所采用的樣品環(huán)也可能影響您的分離性能。理想情況下，選擇應(yīng)用所需的zui低容量的樣品環(huán)。不建議使用大于20 μL的樣品環(huán)。

b.色譜柱的安裝

1. 將色譜柱接入系統(tǒng)之前，清除溶劑輸送系統(tǒng)中的任何有機溶劑或與水不互溶的流動相。連接色譜柱時，按照色譜柱入口端側(cè)面上指示正確溶劑流向的箭頭方向，安裝色譜柱。

2. 用100%水相緩沖鹽，以0.2 mL/min的流速沖洗色譜柱。

3. 確保流動相從色譜柱出口端順利流出。用內(nèi)徑為0.004” 的管路（部件號430001562），將色譜柱出口端連接至檢測器。監(jiān)視系統(tǒng)壓力，確保色譜柱處于其壓力限度以內(nèi)。

4. 逐漸提高流速，每次步進(jìn)不超過0.1mL/min，如第2步所述。

5. 一旦系統(tǒng)壓力穩(wěn)定了，確保無論是色譜柱進(jìn)口端還是出口端都沒有漏液。

c. 色譜柱的平衡

XBridge BEH SEC蛋白分析柱，保存在20%的甲醇水溶液中裝運。在將其轉(zhuǎn)化到不同的流動相體系之前，確保流動相兼容性是至關(guān)重要的。zui少用10倍柱體積的緩沖液來平衡色譜柱（有關(guān)色譜柱體積，請參閱表1）。

表1.空色譜柱體積（單位：mL）（乘以10即為沖洗溶劑體積）。

d. 用于標(biāo)定LC系統(tǒng)和XBridge BEH SEC蛋白分析柱的功能測試

沃特世建議，您在收到色譜柱后以及在柱的整個使用壽命周期內(nèi)，都要進(jìn)行標(biāo)定測試。通過用適當(dāng)?shù)姆椒▽ΤＲ?guī)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，您可以：

■收貨后就確定色譜柱的性能。

■監(jiān)測色譜柱狀態(tài)，以延長使用期。

■對可能發(fā)生的分離問題進(jìn)行故障排查。

沃特世BEH200 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號186006518）和BEH450 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號186006842）即專門為此目的所設(shè)計的產(chǎn)品，經(jīng)仔細(xì)選擇的蛋白質(zhì)和/或肽，可以很好地代表目標(biāo)應(yīng)用。

如下信息詳盡描述了如何配制和使用BEH SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)來進(jìn)行系統(tǒng)基準(zhǔn)化或故障排查。圖2和3提供了分離條件和預(yù)期您應(yīng)該獲得的結(jié)果。

流動相配制

化學(xué)品：

■單水合磷酸二氫鈉

■無水磷酸氫二鈉

■HPLC級別水

配制100 mM磷酸鈉緩沖液（500mL）：

1. 量取500±0.02 g水至500 mL燒杯

2. 量取3.55±0.02 g磷酸氫二鈉，放入500 mL燒杯

3. 量取3.45±0.02 g磷酸二氫鈉，放入500 mL燒杯

4. 攪拌至少30分鐘，然后用0.2 µm膜過濾

5. 測量pH值并記錄以參考（pH值約為：6.8）

圖2.在XBridge BEH SEC 200, 3.5 μm, 7.8x150蛋白分析柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)混標(biāo)分離。

表2. BEH200 SEC測試混標(biāo)。

條件：

儀器： ACQUITY UPLC系統(tǒng)，配TUV檢測器

色譜柱： ACQUITY UPLC BEH200 SEC, 200Å, 3.5μm,7.8 x 150mm

樣品： BEH200 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號186006518）

流動相： 100 mM磷酸鈉，pH 6.8

弱針洗： 100%的Milli-Q 水

強針洗： 100%的Milli-Q 水

密封墊沖洗： 90/10水/甲醇

進(jìn)樣類型： 滿定量環(huán)

進(jìn)樣量： 2 μL

流速： 0.86 mL/min

柱溫： 室溫

檢測： UV@280 nm

圖3. 在XBridge BEH SEC 450, 3.5 μm, 7.8 x150 mm蛋白分析柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)混標(biāo)分離

表3. BEH450 SEC測試混標(biāo)。

條件：

儀器： ACQUITY UPLC系統(tǒng)，配TUV檢測器

色譜柱： XBridge BEH SEC蛋白分析柱，450Å, 3.5 μm, 7.8 x 150 mm

樣品： BEH200 SEC蛋白質(zhì)混標(biāo)（部件號186006518）

流動相： 100 mM磷酸鈉，pH 6.8

弱針： 100%的Milli-Q 水

強針洗： 100%的Milli-Q 水

密封墊沖洗： 90/10水/甲醇

進(jìn)樣類型： 滿定量環(huán)

進(jìn)樣量： 2 μL

流速： 0.86 mL/min

柱溫： 室溫

檢測： UV@280 nm

III. 色譜柱指標(biāo)與使用

為確保XBridge BEH SEC 3.5 μm蛋白分析柱持久的高性能，請遵守以下操作規(guī)范：

a. SEC洗脫液與針洗液的制備

■如果可能，請使用HPLC級的緩沖液、水和有機溶劑。

■使用0.2 μm或更小孔徑的濾膜過濾溶液。對于可以滋生微生物的緩沖液，推薦使用無菌過濾裝置。

■容易滋生微生物的溶液應(yīng)定期更換，以避免色譜柱污染。不要把新配制流動相又倒入舊的SEC流動相樣品瓶中。新鮮配制的SEC流動相，應(yīng)該使用新的溶劑瓶。

■選擇與所用溶液兼容的溶劑進(jìn)樣口過濾器。當(dāng)使用容易滋生微生物的溶液時，要定期清洗或更換過濾器。

b. 樣品制備

■在進(jìn)樣到SEC色譜柱上之前，確保樣品中沒有微粒。如果樣品出現(xiàn)霧狀或渾濁，就不能進(jìn)樣，因為這會導(dǎo)致柱壓 升高?？梢缘脑挘褂眠^濾或離心方式制備樣品。

■如果樣品不能溶解于流動相，請確保樣品、樣品溶劑和 流動相可以互溶，以避免樣品和/或緩沖鹽沉淀。

c. 色譜柱指標(biāo)

■柱裝運溶劑： 20%的甲醇水溶液

■推薦zui大流速和背壓：

■ XBridge BEH SEC 200蛋白分析柱，7.8 x 150 mm:4 mL/min/2,600 psi

■ XBridge BEH SEC 200蛋白分析柱，7.8 x 300 mm:2.7 mL/min/3,200 psi

■ XBridge BEH SEC 450蛋白分析柱，7.8 x 150mm:4 mL/min/2600psi

■ XBridge BEH SEC 450蛋白分析柱，7.8 x 300mm:2.7 mL/min/3200psi

■ 樣品質(zhì)量載量：< 300 μg（對于7.8x150mm）

■ 樣品體積載量：< 60 μL（對于7.8x 150 mm）

■ 推薦的pH值范圍：2～8。色譜柱使用壽命會隨操作溫度以及所用緩沖液的類型和濃度的不同而有所不同。

■ 推薦的鹽濃度：小于或等于0.5 M

■ 推薦的有機相濃度：< 20% 乙腈（警告：許多蛋白質(zhì)在高比例有機相中不可溶。）進(jìn)行色譜分析前，進(jìn)行測試以確保樣品在擬用于色譜分析的有機相濃度下不會發(fā)生沉淀。此外，如果色譜柱在蛋白變性條件（大于10%的有機相）下運行，之后在100%水相條件下使用時色譜柱性能可能會受到影響。

■ 推薦溫度：4 – 60°C。低溫（例如10°C）下操作時要降低流速，以免柱壓過大。

■ 推薦儲存：若要隔夜儲存，用流動相以10-20%的zui大推薦流速持續(xù)沖洗色譜柱。若打算在24小時內(nèi)使用，可將柱保存于HPLC級純水中；或放在10-20%的甲醇中進(jìn)行長期儲存。

注：在壓力、pH值和/或溫度下操作時，會致使色譜柱使用壽命變短。

IV. 故障排查

系統(tǒng)性故障排查的*步，是將色譜柱當(dāng)前狀態(tài)下的性能與正常工作時的性能進(jìn)行比較。用蛋白質(zhì)混標(biāo)進(jìn)行功能測試，可揭示柱填料表面化學(xué)的微妙變化對應(yīng)用的影響。

有幾種常見的色譜柱變化癥狀：

1. 壓力升高通常與應(yīng)用中的性能下降在一起。診斷的*步是確保壓力升高發(fā)生在色譜柱中，而不是在系統(tǒng)中的其他地方。這可通過從出口端到進(jìn)口端逐一斷開連接并同時監(jiān)測系統(tǒng)壓力情況來確定。如果系統(tǒng)被堵塞，則應(yīng)查明堵塞處并排除堵塞。如果增高壓力發(fā)生在色譜柱中，了解問題是與單次進(jìn)樣有關(guān)還是發(fā)生在一系列進(jìn)樣后會很有幫助。如果壓力是逐漸形成的，則很可能需要按第五節(jié)所述對色譜柱進(jìn)行清洗。如果是一個樣品造成的壓力上升，則很可能表示有顆?；虿豢扇艿某煞?，如脂類或較高階聚合物。清洗仍然是一種選擇，但要采用更激烈的方式。如果樣品溶液出現(xiàn)霧狀或渾濁，就不能進(jìn)樣，因為它會導(dǎo)致壓力升高。可以進(jìn)行樣品制備例如過濾或離心，但首先應(yīng)檢查是否會影響結(jié)果。

2. 微生物污染會造成分離度損失和峰拖尾增加。重要的是，遵循良好的標(biāo)準(zhǔn)實驗室操作規(guī)范以預(yù)防微生物污染，包括經(jīng)常更換緩沖液溶劑瓶、使用高純度水、使用無菌過濾裝置、以及在建議的條件下保存系統(tǒng)和色譜柱。如果已經(jīng)發(fā)生微生物污染，清洗色譜柱不會影響性能。改變流速時，請按0.1 mL/min的步進(jìn)速度緩慢增加，避免流速增加時大于0.1 mL/min步進(jìn)。

3. 峰拖尾增加，可能是由于管路連接不當(dāng)，或是由于色譜柱進(jìn)樣端篩板上的物質(zhì)積聚。在繼續(xù)進(jìn)行診斷或采取糾正措施前，請檢查所有的管路連接、流動相是否制備得當(dāng)、并選擇了正確的方法。然后重復(fù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測試。 如果蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品都呈現(xiàn)峰拖尾增加，則很可能在色譜柱入口端有顯著的物質(zhì)累積問題，需要更換色譜柱。

4. 殘留是指一次進(jìn)樣的樣品組分出現(xiàn)在下一次分析譜圖中。在SEC中，殘留一般是由系統(tǒng)部件或不正確的清洗溶劑造成的。進(jìn)行一次空白進(jìn)樣。如果蛋白質(zhì)峰值僅出現(xiàn)在進(jìn)樣時，則它們很可能源于系統(tǒng)部件或清洗溶劑不足。系統(tǒng)部件中的吸附zui可能發(fā)生在進(jìn)樣環(huán)或 針中。在這些情況下，可能需要更換部件。

V. 色譜柱清洗、再生與儲存

a. 清洗與再生

峰形的變化，如增加拖尾、肩峰、保留時間改變、分離度變化、鬼峰或柱背壓升高，都可能表示色譜柱被污染了。選擇一種有望解決疑似污染的清洗方法。

按該色譜柱所采用的典型流速的一半來執(zhí)行清洗程序可能有用。用這種方式，降低了高背壓事件的發(fā)生概率。

推薦的清洗溶劑：

a. 低pH值的高濃度鹽溶液（如：0.5 M Na2SO4, pH 2.7）

b. 低濃度甲醇（如：20%）溶于HPLC級的水中。

c. 如果色譜柱隨后要用于分析天然形態(tài)的蛋白質(zhì)，應(yīng)避免使用離子型洗滌劑和其他表面活性劑。

注：根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇清洗溶劑，如：用(a)去除堿性蛋白， 用(b)去除疏水性蛋白。消泡劑（Chaotropic agents）通過干擾氫鍵作用使強烈吸附的蛋白質(zhì)溶劑化。

作為后的手段，可以嘗試在低流速（如0.1 mL/min）下進(jìn)行倒 流或反沖洗。然而，這種方法可能會進(jìn)一步損害色譜柱，或者只能提供短暫的性能改進(jìn)。

b. 儲存

若要隔夜儲存，用流動相以10～20%的zui大推薦速度持續(xù)沖洗色譜柱。若打算在24小時內(nèi)使用，將色譜柱儲存在HPLC級的純水中；或放在20%的甲醇中作為長期儲存。

注：在壓力、pH和/或溫度條件下操作，會縮短色譜柱使用壽命。